近日，我所生物技術研究部生物分離分析新材料與技術研究組（1809組）葉明亮研究員團隊和中國科學院上海藥物研究所羅成研究員團隊合作，利用蛋白質在結合配體后局部穩定性的變化，開發了一種在復雜體系中可以同時高靈敏鑒定配體結合蛋白和結合位點的蛋白質組學新方法。該方法無需對配體進行化學修飾，廣譜適用于包括代謝物、藥物、污染物等不同結構配體的靶蛋白質分析。
生物體通過配體與蛋白質上的特定位點結合而實現特定的生物功能，例如，代謝物與蛋白質結合使細胞感知營養狀態，藥物與蛋白質結合調控機體生理狀態等。在細胞內外環境中存在著包括代謝物、金屬離子、核酸、蛋白質、藥物等各種各樣的配體分子，它們與蛋白的相互作用影響生物體的生理病理過程。深入理解配體的結合蛋白質和結合位點有助于揭示配體在生命活動中的作用機制，對認識復雜生命體系、解析疾病機制、推動藥物研發等具有重要意義。
傳統結合位點和結合親和力的測定需要重組表達純化蛋白質，再綜合利用核磁、表面等離子共振等技術才能實現，費時費力；且重組表達的蛋白質與細胞中的蛋白質天然狀態可能不同，使得測定的結果經常與生理狀態有較大的差異。此外，傳統配體靶蛋白質組學鑒定方法需要針對不同蛋白質，設計優化保持配體活性的方案，缺乏廣譜適用性，且很難鑒定相互作用較弱的靶蛋白。
研究人員發現，采用大量的胰蛋白酶對自然狀態下的蛋白質進行酶切，使之直接產生適合質譜檢測的肽段，能夠對配體結合引起的局部穩定性變化產生放大作用。基于該發現，研究人員開發了以肽段為中心的蛋白質局部穩定性探測方法（PEptide-centric Local Stability Assay，PELSA），用于配體靶蛋白質的鑒定。PELSA方法無需對配體進行化學修飾、不依賴親和力大小，直接能在細胞裂解液等復雜樣品中發現與配體結合發生局部穩定性變化的蛋白質，從而實現配體結合蛋白質、結合位點以及局部親和力的系統解析。
PELSA方法具有較高的鑒定靈敏度，在模型藥物星孢菌素靶蛋白的鑒定中，與現有同類的技術（LiP-MS）相比，利用該方法的靶蛋白鑒定靈敏度提高了12倍；與目前廣泛使用但缺乏結合位點信息的熱蛋白質組技術（TPP）相比，該方法的靶蛋白鑒定靈敏度提高了2.4倍。此外，劑量依賴的PELSA方法可以測定局部親和力，從而揭示生理狀態下蛋白質在結合配體后三維結構的動態變化。研究人員將PELSA方法用于藥物、金屬離子、翻譯后修飾肽段及抗體等多種配體的結合蛋白鑒定，均展現出高靈敏的靶蛋白鑒定性能和精準的結合區域定位能力，證明了PELSA方法可以作為一個通用的分析平臺，研究各種配體與蛋白的相互作用。
由于代謝物種類繁多，結構多樣，有些分子結構簡單，常以接近細胞生理濃度的親和力（微摩每升到毫摩每升）與感受蛋白相互作用，二者相互作用的解析長期依賴于生物學家的生物學假設和實驗，分析通量有限。本工作開發的PELSA方法非常適合代謝物靶蛋白質的系統鑒定，研究人員利用PELSA方法一次性在HeLa細胞裂解液中鑒定到40個α-酮戊二酸的作用蛋白，其中有30個是大量文獻積累的已知作用蛋白，說明該方法靶蛋白鑒定的高靈敏度和高可信度。研究人員進一步將PELSA方法應用于葉酸、亮氨酸、富馬酸及琥珀酸等代謝物的作用蛋白鑒定，展示了該方法的廣譜適用性。
本工作開發的PELSA方法在代謝物、藥物及污染物的識別及作用機制解析等領域具有廣泛的應用價值。
近年來，葉明亮團隊在靶標蛋白質鑒定方面發展了一系列蛋白質組學方法，包括pH沉淀（pHDPP）、有機溶劑沉淀（SIP）、機械力誘導蛋白沉淀（MSIPP）等變性新方法（Chem. Sci.，2022；Anal. Chem.，2020；Anal. Chim. Acta.，2021），以及矩陣熱遷移分析方法（mTSA）（Anal. Chem.，2022）、微球輔助的熱致蛋白沉淀（MAPS）（Anal. Chem.，2020）等方法，并應用在鑒定中藥紫草素、雙青蒿素、持久性污染物全氟辛磺酸、肝毒性化合物格爾德霉素的靶蛋白中。此外，為了能夠在蛋白質組水平識別藥物結合靶標和結合位點，葉明亮團隊還發展了基于賴氨酸反應活性的方法等（Anal. Chem.，2022）。
相關研究成果以“A peptide-centric local stability assay enables proteome-scale identification of the protein targets and binding regions of diverse ligands”為題，于近日發表在《自然-方法》（Nature Methods）上。該工作的第一作者是1809組已畢業博士研究生李柯佳。上述工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、我所創新基金等項目的支持。（文/圖 李柯佳、李亞楠、王龑）
